細胞狀態差？這次可能是細胞老化

上海融禾醫藥     2021-12-13 14:48

大家在養細胞的時候，想必大家也一定遇到過細胞狀態差這種情況，但是細胞狀態差，有很多種原因造成？

細胞狀態很差，常常出現的現象是：細胞邊緣不清晰、細胞不飽滿、折光性差、背景比較臟、黑點很多、細胞碎片多（細胞凋亡后的細胞碎片）、單個細胞內有空泡（凋亡）且空泡比較多；如果細胞出現老化，也就是細胞比較扁平、增殖減緩、細胞核體積增大、細胞突觸變多，此時觀察到的細胞狀態也是不正常的。所以，除了考慮血清和細菌污染的問題，細胞老化也不容忽視~

首先，我們要知道什么是細胞老化？

何為細胞老化？

1882年，德國生物學家Weismann曾大膽預測“在細胞水平存在老化現象”。他推測：機體的壽命限制受控于體細胞的分裂能力；在遺傳進化中，不同物種的體細胞獲得了不同分裂的潛能，從而決定了不同物種的壽命長短。

20世紀50年代，Swin和他的同事利用原代細胞體外培養試驗證明了來源于不同物種的纖維細胞均不具備無限分裂的潛能。取得突破性進展的還是Hayflflick和Moorhead，他們做了更系統更細致的觀察和描述，他們對25株人成纖維細胞進行原代培養，在這個過程中發現，經過約50次傳代之后，所有細胞出現功能退化，并且喪失分裂能力的現象。此后人們將這一現象稱之為“Hayflflick極限”或者自發性老化。之后也有事實證明，細胞老化并不是體外培養所導致，細胞在體內也會隨著年齡的增長，逐步走向老化。

細胞老化的征兆

細胞周期阻滯

長期的細胞周期阻滯是老化細胞的基本特征，也是體外鑒定細胞老化不可或缺的指標。為了檢查細胞是否躍出了細胞周期，人們通常檢測增殖指示分子Ki-67的表達豐度；或者通過將與胸腺嘧啶相似的溴脫氧尿嘧啶（Bromodeoxyuridine，BrdU）摻入到細胞培養基中，觀察是否有新的DNA合成。細胞老化主要表現為G1期阻滯，個別情況下也可伴隨G2/M期周期阻滯，或直接由G2/M期阻滯誘發形成。

細胞形態改變

雖然由于細胞周期的中斷和DNA復制的停止，老化細胞內的DNA含量與正常細胞類似，但 RNA與蛋白質豐度均比正常細胞要明顯升高。這是因為，盡管細胞進入老化階段后蛋白質的整體合成速率降低，但是蛋白質的降解體系受到更加明顯的抑制，導致蛋白質在細胞內持續堆積。但，由于不同組織來源的細胞，其形態本就各不相同，因此，目前還并無客觀的、統一的標準從細胞形態判斷并定義老化細胞。換句話說，目前并不能直接根據細胞的形態去判斷是否老化細胞。

無論是原代細胞或是細胞株，在細胞培養過程中細胞老化現象是存在且常見的，但卻容易被操作人員忽略，老化的細胞會出現的特征包括：細胞增殖變慢、細胞核體積異常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、細胞體積增大、細胞扁平、細胞質中出現空泡等現象。

總結

研究表明,衰老細胞的細胞核、細胞質和細胞膜等均有明顯的變化：
①細胞內水分減少,體積變小,新陳代謝速度減慢；
②細胞內酶的活性降低；
③細胞內的色素會積累；
④細胞內呼吸速度減慢,細胞核體積增大,核膜內折,染色質收縮,顏色加深.線粒體數量減少,體積增大；
⑤細胞膜通透性功能改變,使物質運輸功能降低.
形態變化
總體來說老化細胞的各種結構呈退行性變化.衰老細胞的形態變化表現有：
1、核：增大、染色深、核內有包含物 
2、染色質：凝聚、固縮、碎裂、溶解 
3、質膜：粘度增加、流動性降低 
4、細胞質：色素積聚、空泡形成 
5、線粒體：數目減少、體積增大 
6、高爾基體：碎裂 
7、尼氏體：消失 
8、包含物：糖原減少、脂肪積聚 
9、核膜：內陷
分子水平的變化
1、DNA：從總體上DNA復制與轉錄在細胞衰老時均受抑制,但也有個別基因會異常激活,端粒DNA丟失,線粒體DNA特異性缺失,DNA氧化、斷裂、缺失和交聯,甲基化程度降低.
2、 RNA：mRNA和tRNA含量降低.
3、蛋白質：含成下降,細胞內蛋白質發生糖基化、氨甲?；⒚摪被刃揎椃磻?導致蛋白質穩定性、抗原性,可消化性下降,自由基使蛋白質肽斷裂,交聯而變性.氨基酸由左旋變為右旋.
4、 酶分子：活性中心被氧化,金屬離子Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+等丟失,酶分子的二級結構,溶解度,等電點發生改變,總的效應是酶失活.
5、脂類：不飽和脂肪酸被氧化,引起膜脂之間或與脂蛋白之間交聯,膜的流動性降低.如下圖：

                                                                                圖1 HEK293細胞  

                                                                           圖2 MSC細胞

由上圖可知細胞老化，出現細胞體積增大、細胞扁平。

那我們該如何防止細胞老化？

1. 不要等細胞長得太滿才傳代。細胞太密會導致細胞狀態下降，產生細胞接觸性抑制。

2. 細胞不要消化過度。采用胰蛋白酶消化細胞，會造成細胞表面一定程度的細胞損傷。

3. 最重要的是使用優質的血清和培養基：干細胞對培養基中的內毒素非常敏感。除了要留意基礎培養基的內毒素外，也要留意血清的內毒素。如果血清中內毒素≥3EU/ml時，干細胞很容易老化或死亡，導致細胞“亞健康”狀態，導致實驗受到影響。很多使用者，在血清在試用前，就會通過提早審核該批次《檢測報告》，以決定是否入圍進行試用。

4. 在開始養細胞并傳代時，也要特別注意凍存細胞，以保持細胞有種子庫存在，可以有效避免細胞損傷。